Western Blot

Ein Western Blot ist eine weit verbreitete biochemische Technik, die zur Identifizierung und Quantifizierung spezifischer Proteine in einer Probe verwendet wird. Diese Methode nutzt Gel-Elektrophorese, um Proteine nach ihrer Größe zu trennen, und spezifische Antikörper, um das ge-wünschte Protein zu erkennen.
Zelllysate oder Proteinextrakte werden vorbereitet, um die gewünschten Proteine freizusetzen. Dabei werden oft proteasehemmende Mittel hinzugefügt, um den Abbau der Proteine zu verhindern.

Die Proteine der Probe werden anschließend durch SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyac-rylamide Gel Electrophoresis) getrennt. SDS ist ein Detergens, das Proteine denaturiert und sie mit einer negativen Ladung versieht, sodass sie nach ihrer Größe (Molekulargewicht) getrennt werden können.
Die getrennten Proteine werden aus dem Gel auf eine Membran (meist Nitrocellulose oder PVDF) übertragen. Dieser Prozess wird als „Blotting“ bezeichnet und kann durch elektrochemischen Transfer (elektrophoretischer Transfer) erfolgen.

Nun wird die Membran wird mit einer Blockierungslösung inkubiert (z.B. mit BSA oder Milch-pulver), um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren und so Hintergrundsignal zu reduzieren.
Der Nachweis spezifischer Proteine erfolgt nun mit Antikörpern. Die Membran wird zuerst mit einem primären Antikörper inkubiert, der spezifisch an das Zielprotein bindet. Danach wird ein sekundärer Antikörper hinzugefügt, der an den primären Antikörper bindet und meistens ein En-zym (z.B. Horseradish Peroxidase, HRP) oder ein fluoreszierendes Molekül trägt.

Das gebundene Enzym auf dem sekundären Antikörper katalysiert eine Reaktion, die ein detek-tierbares Signal erzeugt (chemilumineszente oder fluoreszierende Signale), das auf einem Film oder durch ein digitales Bildgebungssystem sichtbar gemacht wird. Die Intensität des Signals kor-reliert mit der Menge des Zielproteins in der Probe.